喹諾酮類藥物殘留分析技術前處理方法——凈化方法

時間：2023-03-25 02:50:13來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

喹諾酮類藥物殘留分析技術前處理方法——凈化方法

[db:作者] / 2022-12-19 00:00

(2)凈化方法

經典的凈化處理方法有固相萃取(SPE)。隨著科學技術的發展和曾藥殘留檢測要求的不斷提高，各種新技術、新手段也被用來作為生物樣品中QNs的樣品前處理方法，主要包括:固相微萃取(SPME)、基質固相分散萃取(MSPD)、分散固相萃取(DSPE)、分子印跡(MIP)、免疫親和色譜(IAC)等。

1)固相萃取(solid phase extraction，SPE)

QNs的SPE凈化方法主要用于極性溶劑提取組織樣品后的凈化。通常在SPE凈化前需要用正已烷進行脫脂。常用的SPE填料主要包括硅膠基C18、聚乙烯-苯乙烯-二乙烯基苯等聚合物(如PSDVB、ENV+、SBD-RPS、HLB、StrataX等)、離子交換劑(如SCX、PRS、MPC)和納米纖維等。QNs為酸堿兩性物質，所以SPE固相基質對QNs的保留主要依靠樣品載液的pH。Golet等將樣品溶液調節為pH3.0，用MPC固相萃取柱凈化，回收率達80%以上。Ferdig等專門比較了三種不同的聚合固相萃取柱OasisHLB、IsoluteENV+、Lichrolut EN+和三種不同的硅膠基反相柱Chromabond C8、Chromabond Tetracyeline、Bakerbond phenyl的保留、凈化效果，結果發現，以上6種是柱對兩性QNs均能有很好的回收率，而對酸性QNs如OXO、FLU的回收率較差。Bailac等建立了SPE-HPLC方法檢測雞組織中的7種QNs(CIP、DAN、ENR、SAR、DIF、OXO、FLU)。比較了Oasis HLB、Oasis mAX和SDB-RPS固相萃取柱的凈化效果，除了CIP在Oasis MAX柱的回收率低于25%，其他QNs在3種SPE柱都可以取得滿意的回收率，而SDB-RPS用于樣品前處理效果最好，回收率為58%～107%，LOD為10～30μg/kg。Samanidoua等用HLB固相萃取柱凈化魚肉中的7種QNs(CIP、ENR、SAR、DAN、OXO、NAL、FLU)。1g魚肉中加入5mL 0.1mol/L NaOH溶液和0.2g NaCl，渦動1min，超聲15min后，3500r/min離心10min，取上清液。再向組織中加入3mL 0.1mol/L NaOH溶液和0.1g NaCl，渦動、超聲、離心，重復提取1次，合并上清液，0.2um濾膜過濾，HLB固相萃取柱凈化。方法的回收率為90%～132%，RSD低于20%，LOQ為6～8ug/kg。趙思俊等建立了SPE-HPLC法檢測動物肌肉組織中7種QNs的殘留。該方法采用在不借助高速離心的條件下(3500r/min)，用較短時間(渦動10s，離心5min)，以0.05mol/L磷酸鹽溶液(pH7.0)提取兩次、HLB固相萃取柱凈化的前處理方法。應用該方法在3h內可完成32個組織樣品的前處理(包括提取、凈化)。在整個提取、凈化過程中僅使用了不到5mL甲醇。豬肉、雞肉中的平均回收率為70.4%～105.8%。鄧思維等建立了納米纖維SPE-HPLC檢測湯液中5種QNs的分析方法，樣品經EDTA-Mcllvaine緩沖溶液(pH4)提取后，納米纖維(磺化聚苯乙烯-聚乙烯吡咯烷酮共紡物纖維)SPE小柱凈化富集，水淋洗，2%氨化甲醇洗脫，HPLC-FLD于激發波長280nm、發射波長450nm處進行檢測，流動相為甲醇-水-磷酸(25+75+0.1，v/v/v，三乙胺調至pH2.8)。FLE、NOR、SAR、CIP和ORB的回收率為72.1%～110.3%；日內RSD為1.6%～4.3%，日間為2.0%～4.3%，LOD為1.2-5.4g/L，LOQ為3.9-18g/L。

2)固相微萃取(solid phase microextraction，SPME)

SPME具有操作簡便、不需溶劑、萃取速度快，便于實現自動化以及易于與色譜、電泳等高效分離檢測手段聯用，并適用于氣體、液體和固體樣品分析的、新穎的樣品前處理技術等突出的優點。與SPE相比，SPME法具有萃取相用量更少、對待測物的選擇性更高、溶質更易洗脫等特點。黃京芳等采用毛細管整體柱管內SPME與HPLC在線聯用測定血漿中的OFL、CIP、NOR、ENR和SAR。經過對5種QNs在整體柱上的萃取條件進行系統優化，選用25mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH4.1)為固相微萃取攜帶液，解吸液和流動相均為25mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH2.1)-甲醇-乙腈(72+20+8，v/v/v)，萃取時間為10min，萃取流速為0.04mL/min。結果在測定血漿中的5種QNs時，無基質干擾現象，LOD為1.1～2.6μg/L。Theodoridis等建立了SPME方法凈化尿液中的CIP、奎寧、萘普生、氟哌啶醇和紫杉醇，離線HPLC-DVD檢測。研究發現CIP在中性環境萃取效率最高，萃取液為0.9% NaCl溶液，解吸液為甲醇，萃取時間為20min。CIP的回收率為85%，LOQ為0.4μg/mL。

3)基質固相分散萃取(matrix solid phase dispersion，MSPD)

MSPD是將樣品與填料一起混合研磨，使樣品均勻分散于固定相顆粒表面，制成半固態后裝柱，然后根據“相似相溶”原理選擇合適的洗脫劑洗脫。該技術濃縮了傳統樣品前處理中勻漿、組織細胞裂解、提取、凈化等多個過程，避免了待測物在這些過程中的損失，提取凈化效率高、耗時短、節省溶劑、樣品用量少，但研磨的粒度大小和填裝技術的差別會使淋洗曲線有所差異，不易標準化。喬鳳霞等以C18為MSPD分散劑，采用MSPD技術進行樣品前處理，建立了MSPD-HPLC法分析牛奶和蜂蜜中4種QNs的方法，2.5ng/g和10.0ng/g添加水平，平均加標回收率為81.9%～11.6%，RSD低于7%，LOD為0.05μg/L。王煉等建立了MSPD-LC-MS/MS方法測定畜禽肉和牛奶中的β-內酰胺類、大環內酯類和QNs等20種獸藥殘留，樣品與C18填料(粒徑40～75um)混合，進行MSPD提取，以甲醇洗脫待測物，氮氣吹掃，流動相溶解殘余物后分析，方法的LOD和LOQ分別為0.05～3.05g/kg和0.16～10.0g/kg，禽畜肉和牛奶樣品的回收率分別為73.8%～101.5%和71.2%-～95.3%，RSD分別為2.0%～13.5%和2.0%～14.1%。

4)分散固相萃取(dispersive solid-phase extraction，DSPE)

DSPE是在SPME的基礎上發展起來的一種新型樣品前處理技術。Tsai等建立了DSPE方法凈化豬肌肉組織中的SAR、DAN、NAL、OXO、ENR、FLU和哌啶。5g肌肉組織置于50mL離心管，加入5mL乙腈(含50μL 70%～72%高氯酸)，均質后加入2g無水硫酸鎂和1g氯化鈉，振蕩混合1min，10000r/min離心4min，取1.5mL上層乙腈溶液加入裝有30mg分散吸附劑(PSA)的離心管中，立即加入10uL 1 mol/L氫氧化鈉溶液，渦動混合10s，6500r/min離心1min后，用玻璃移液管盡可能移去溶液層，固體吸附劑用氮氣吹干，500μL解吸溶液(水-乙腈-70%-72%高氯酸溶液)(10+2+88，v/v)加到干燥的吸附劑中，渦動混合30s，6500r/min離心1min，過0.45um濾膜，HPLC分析。回收率為95.5%～111.0%，LOD為7.5～26.3μg/kg。曹鵬等建立了DSPE-UPLC-MS/MS同時檢測食材中11種QNs的方法。樣品用5%甲酸乙腈溶液提取后加入鹽析劑分層，提取液中加入C18和PSA填料進行凈化，濃縮后經C18色譜柱分離，用電噴霧離子源正離子多反應監測模式串聯質譜進行檢測。11種藥物在1.0～100.0μg/kg范圍內具有較好的線性關系，相關系數均大于0.998。該方法的LOD為1.8～3.1μg/kg，LOQ為6.0～10.3μg/kg；11種藥物的回收率為70.1%～100.3%，RSD為2.42%～10.88%。

QuEChERS是近年來國際上最新發展起來的一種用于農產品檢測的快速樣品前處理技術。其原理與DSPE相似，都是利用吸附劑填料與基質中的雜質相互作用，吸附雜質從而達到除雜凈化的目的。曲斌等建立了生鮮牛乳中8種QNs的QuEChERS-UPLC-MS/MS測定方法。取生鮮牛乳樣品5g，加入5mL 0.1mol/L的EDTA-Mcllvaine緩沖液(pH4.0)和20mL乙腈，振蕩提取20min，再加入Bond-ElutQuEChERS萃取劑振蕩提取5min，4℃下1000r/min離心5min，取.上清液10mL置于凈化管，渦旋1min，4℃下1000r/min離心5min，取上清液，氮氣吹干，復溶后UPLC-MSMS測定。方法對QNs的測定線性范圍為2.0～100μg/kg，在2.0μg/kg、10ug/kg、100μg/kg低、中、高3個濃度的回收率為80%～120%，批內、批間RSD小于20%。Karami-Osboo等報道了使用QuEChERS分散液-液微萃取法萃取測定牛奶樣品中的6種QNs(MAR、NOR、CIP、DIF、ENR和DAN)。DAN和其他QNs的LOD分別低于2.5μg/kg和15μg/kg，回收率為69.2%～104.8%，日內和日間RSD分別為2.1%～11.1%和1.6%～6.5%。曹慧等采用QuEChERS-UPLC-MS/MS技術同時測定乳制品中磺胺類和QNs殘留。樣品加乙腈提取，經QuEChERS凈化后，采用C18色譜柱分離，以乙腈和0.1%的甲酸水溶液為流動相進行梯度洗脫，采用電噴霧-正離子多反應監測模式，內標法定量。在1～200μg/L的質量濃度范圍內，磺胺類和QNs的相關系數均大于0.9965，該方法的LOD在0.3～2.5μg/kg之間，LOQ在1.0～7.5μg/kg之間；添加10μg/kg、20μg/kg、50μg/kg三個濃度水平，磺胺類和QNs的平，均回收率在71.6%～120.7%之間，RSD在0.1%～7.2%之間。

5)分子印跡技術(molecular imprinting technology，MIT)

MIT是指為獲得在空間結構和結合位點上與模板分子相匹配的聚合物制備技術，是一門源于高分子化學、生物化學、材料化學等的交叉學科。分子印跡就是仿照抗原抗體的形成機理，在印跡分子(imprinted molecule)周圍形成高交聯的剛性高分子，除去印跡分子后在聚合物的網絡結構中留下具有結合能力的反應基團，對模板分子表現出高度的選擇識別能力。MIT作為凈化方法被廣泛用于QNs的前處理，如分子印跡固相萃取(molecularly imprinted solid-phase extraction，MISPE)、磁性分子印跡聚合物萃取(magnetic molecularly imprinted polymer extraction，MMIPE)、水兼溶性分子印跡固相萃取(water-compatible molecularly imprinted solid-phase extraction)等。

劉芃巖等建立了復合模板印跡聚合物凈化LC-MS法測定魚肉中QNs殘留。該研究同時以LEV和CIP為模板分子，a-甲基丙烯酸(MAA)為功能單體，三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM)為交聯劑，合成了復合模板分子印跡聚合物(MIP)，以此聚合物制備MIP-SPE柱，富集凈化魚肉樣品，結合高效液相色譜-離子阱質譜(HPLC-ITMS)同時測定魚肉中10種QNs殘留量的方法。采用2%醋酸乙腈提取樣品，提取液經正己烷脫脂后，過自制的復合模板MIP-SPE柱凈化，以0.05%甲酸溶液和乙腈為流動相，梯度洗脫程序進行色譜分離，離子阱質譜進行定性和定量分析。方法的回收率為80.6%～104.6%，RSD小于8.6%，LOD為0.11～0.25μg/kg，LOQ為0.35～0.84μg/kg。汪雪雁等建立了分子印跡固相萃取-高效毛細管電泳檢測雞肉中ENR的方法。以ENR為模板分子，MAA為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)為交聯劑，制備了ENR的MIP。以該聚合物為固相萃取材料制備MIP-SPE柱，采用高效毛細管電泳分離，紫外檢測器檢測。結果ENR的LOD為92.02ug/kg，LOQ為336.04μg/kg，回收率為77.84%～86.52%，RSD為2.18%～3.76%。Sun等在甲醇-水體系中以OFL為模板分子、MAA為功能單體合成水兼溶性MIP，并以此聚合物為吸附劑制備SPE柱，分離凈化尿液中的9種QNs(PIP、OFL、ENO、PEF、NOR、CIP、ENR、GAT、SAR)。結果顯示，對QNs具有高親和力，凈化后HPLC檢測，LOD為0.036～0.10μg/mL。Urraca等采用MIP微球選擇性萃取雞肌肉樣品中的6種QNs，用組合篩選的方法選擇最佳聚合物合成的功能單體和交聯劑。MIP的制備使用ENO作為模板，MAA和三氟甲基丙烯酸混合作為功能單體，EDMA作為交聯劑與其他材料相比顯示出較高的QNs識別特性。使用二氧化硅作為骨架制備MIP球狀粒子，聚合物裝填于固相萃取柱內，用體積比為20：80的乙腈-水(含0.005%三氟乙酸，pH3.0)沖洗，含5%三氟乙酸的甲醇洗脫，HPLC或者液相色譜-質譜(LC-MS)檢測。雞肌肉樣品中目標QNs的回收率為68%～102%，RSD為3%～4%(n=18)，LOD為0.2～2.7μg/kg。

6)免疫親和色譜(immunoaffinity chromatography，IAC)

IAC是以免疫結合反應為基礎的柱色譜技術。其原理是將抗體與惰性基質偶聯制成免疫吸附劑，裝柱。當待測組分流經IAC柱時，抗原與相應抗體進行選擇性結合，其余雜質則流出IAC柱。再利用適宜的洗脫劑將抗原洗脫，使待測物得到有效分離、凈化和濃縮。并且IAC柱再生處理后可重復使用。混合抗體免疫親和柱(multi-immunoaffinity，MIAC)和高效免疫親和色譜(high-performance immunoaffinity chromatography，HPIAC)是其發展方向。MIAC是指含多種抗體或群特異性抗體的IAC柱，它能同時對多種組分進行分離凈化，具備了處理多殘留組分的能力。HPIAC多采用鍵合相硅膠或控制孔徑的玻璃珠，是IAC的選擇性和HPLC高效分離的完美結合。

Holtzapple等以SAR為半抗原制備抗體并與蛋白G偶聯，制備免疫親和色譜柱，采用自動在線免疫親和色譜方法提取雞肝臟中的4種QNs，免疫親和色譜柱洗滌后，QNs被直接洗脫到苯基反相色譜柱，以2%乙酸-乙腈(85+15，v/v)為流動相，等度洗脫，熒光檢測器檢測，激發和發射波長分別為280nm和444nm。結果發現，樣品基質無干擾雜質，凈化良好。在3個添加濃度(20ng/g、50ng/g和100ng/g)的回收率為85.7%～93.5%，SD低于5%，LOQ為1ng/mL，CIP、ENR、SAR、DIF的LOD分別為0.47ng/mL、0.32ng/mL、0.87ng/mL和0.53ng/mL。在另外一項研究中，Holtzapple等以SAR為半抗原制備高親和力的單克隆抗體并與蛋白G偶聯，制備HPIAC，將HPIAC直接與HPLC連接，分離和檢測血清中的2種QNs。由于抗體的高選擇性，該方法沒有使用有機溶劑和傳統的液相色譜柱。ENR的回收率為89%～102%，平均回收率為94%，LOD為0.8ng/mL；SAR的回收率為91%～106%，平均回收率為98%，LOD為1.7ng/mL。Holtzapple等還建立了在線HPIAC-反相HPLC-FLD方法檢測牛血清中的4種QNs(CIP、ENR、SAR、DIF)。HPIAC與反相HPLC相連接，FLD的激發和發射波長分別為280nm和444nm。CIP、ENR、SAR、DIF的平均回收率分別為99.2%、102.3%、97.8%和101.49%，平均日內RSD和平均日間RSD分別為3.0%和4.9%，LOD分別為3.2ng/mL、1.8ng/mL、4.7ng/mL和2.8ng/mL，4種QNs的LOQ為3.2ng/mL。Li等建立了新型MIAC方法，將磺胺類和QNs的廣譜特異性單克隆抗體同時偶聯與Sepharose4B，制備出可以同時分離和凈化豬和雞肌肉組織中13種QNs和6種磺胺類藥物的IAC柱，LC-MS/MS檢測。以磺胺甲嗯唑為半抗原制備的一種新型單克隆抗體對6種磺胺類藥物的交叉反應率為31%～112%，通過優化相關條件，所制備IAC柱可以同時分離凈化QNs和磺胺類藥物。動物組織中19種藥物的回收率為72.6%～107.6%，日內和日間的SD分別低于11.3%和15.4%，LOQ為0.5～3.0ng/g。趙思俊等利用IAC凈化技術建立了可同時檢測動物肝臟組織中10種QNs(MAR、CIP、NOR、DAN、LOM、ENR、SAR.DIF、OxO和FLU)的HPLC檢測方法。對利用QNs抗體制備的IAC柱的性能、操作條件進行了考察和優化。抗體的偶聯量為5g/L，其對10種QNs的柱容量為3.75～6.67umol/L gel (1425～2135mg/L gel)，選用甲醇-PBS(7+3，v/v)作為洗脫溶液，連續使用12次后，QNs的柱容量仍能達到初始柱容量的38%～45%。IAC柱重復使用20次后，藥物的回收率與樣品的凈化效果無明顯變化。動物肝臟組織樣品用PBS溶液提取，IAC柱凈化，HPLC-FLD檢測，方法的線性范圍為0.15～200μg/L，相關系數大于0.9989，LOD為0.05～0.15μg/kg，10種QNs在動物肝臟的平均回收率為74.7%～94.8%，RSD為3.9%～12.1%。

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