β-內酰胺類藥物的殘留檢測（一）

[db:作者] / 2022-12-09 00:00

5.1.4.2測定

β-內酰胺類藥物的殘留檢測方法已有大量報道，主要有微生物檢測法、免疫檢測法、色譜法以及色質聯用法，而色譜法主要包括液相色譜法(LC)、氣相色譜法(GC)和薄層色譜法(TLC)等。免疫檢測法的優點在于費用相對較低，便于使用，方便攜帶，適合現場開展工作，具有高選擇性和靈敏度，具有很大的發展前景；而微生物法和理化檢測法則較為成熟。20世紀90年代以后，在β-內酰胺類藥物殘留分析方法中LC法占絕對優勢，并隨著質譜技術的發展，色質聯用儀器的逐步普及，液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)技術以其選擇性好、靈敏度高、分析速度快、不需衍生化、可同時定性定量等優點成為目前β-內酰胺類藥物殘留分析中最主要的手段。

(1)微生物法

微生物法是建立在抗生素能抑制細菌生長原理的基礎上，能簡單快速地測定所有抗生素殘留的一種篩選檢測技術。這些傳統檢測方法的主要優點是廉價，易于操作和適于大量樣品的篩選，但所需時間長，顯色狀態需通過肉眼判斷，易產生誤差。同時，由于具備抑菌作用的抗生素種類繁多，而動物源食品中干擾物質又多，結果造成假陽性率較高，方法缺乏特異性。Stead等對微生物法測定牛奶中10種抗生素(包括6種β-內酰胺類藥物)進行了評價。取100μL牛奶至瓊脂平板，經塑料膜密封后放置水浴鍋中孵育(64℃)3h，Delvo檢測試劑盒判定檢測終點。當添加水平在歐盟規定的殘留限量水平時，檢出陽性結果的正確率為100%。Wachira等使用低成本的微生物方法測定雞組織中的青霉素G。采用蠟樣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌瓊脂擴散，在pH7的條件下，在測試板上測定肝臟和腎臟樣品中青霉素G的濃度均低于MRL(50ng/g)，且2倍的LOD也低于MRL，可有效地用于青霉素G的常規篩查。Ang等對微生物法和LC法測定牛奶中阿莫西林和氨芐青霉素進行了對比。微生物法操作如下：將樣品加至平板孔內，每份樣品4個平板，對照樣品單獨加樣。然后將平板置64℃孵育3h，孵育后測定抑菌圈。將10ng/mL設定為曲線的校準點，繪制標準曲線，校準平均值獲得藥物濃度。結果表明兩種方法測定結果一致，但LC法比微生物法靈敏度高。

(2)薄層色譜法(thin layer chromatography，TLC)

TLC在獸藥殘留的快速篩選檢測方面應用廣泛，特別是高效薄層色譜法(HPTLC)的斑點原位掃描定量、定性和高效分離材料彌補了常規TLC在靈敏度和重復性方面的不足，還保持了TLC的簡便、快速和樣品容量大的優點，可使用正相或反相，分辨率幾乎與HPLC相當。動物組織中殘留的氨芐西林、芐青霉素和苯甲氧基青霉素有采用TLC分析的報道，固定相主要是硅膠或纖維素。除個別學者使用自動射線照相色譜檢測閃爍計數器定量外，其他的TLC方法多使用生物抑制法進行檢測和定量。這種技術的缺點是操作復雜、時間長、重現性較差，而且炅敏度低，LOD通常為50μg/kg。Grzelak等建立了一種檢測牛奶中頭孢乙腈、頭孢呋辛的TLC分析方法。該方法采用的TLC板為Si 60 F254(10cm×20cm)，分離獲得的條帶在254nm波長處進行檢測。TLC平板用正己烷除去牛奶樣品中的脂肪，再用甲醇-甲苯-乙酸乙酯-98%甲酸(5+20+65+10，v/v)作為展開劑，結果顯示頭孢乙腈回收率為97.66%，頭孢呋辛為86.13%。盧英強等建立了一種快速鑒定動物皮膚或肌肉組織中青霉素的TLC方法，將組織勻漿，經0.2moL/L H2SO4酸化，用3倍體積的乙酸乙酯浸泡24h，分離提純后，置75℃水浴中濃縮。TLC展開系統：氯仿-苯-冰乙酸(2+2+1，v/v)，展開后，室溫條件下自然干燥15min，取出層析板，計算Rf值和觀察色斑。結果發現，從動物組織中分離提純青霉素獲得的色斑與青霉素標準品色斑和Rf值完全相同，層析色譜清晰。

(3)毛細管電泳法(capillary electrophoresis，CE)

CE具有高柱效、分析時間短、樣品范圍寬等特點。但由于電滲流的不穩定，CE的重現性較差，且進樣量太小，造成檢測靈敏度較低。目前，CE已發展出多種不同的分離模式，如毛細管區帶電泳(CAE)、膠束電動毛細管色譜(MEKC)、毛細管等電聚焦(CIEF)、毛細管凝膠電泳(CGE)和毛細管等速電泳(CITP)等，使其在抗生素分析中得到快速發展。陳號采用HPCE方法來評價青霉素GIAC柱的柱效。采用涂層石英毛細管柱(50um×60cm)，分離電壓18kV，二極管陣列檢測器(DAD)檢測波長198nm，溫度25℃，緩沖液為30mmoL/L硼砂緩沖液(pH3.8)。HPCE檢測標準曲線在1～100ug/mL范圍內線性良好，青霉素G樣品添加回收率為76.38%～94.67%，CV為5.67%～15.91%。朱丹成用CAE測定氨芐青霉素的含量，緩沖液為25mmoL/L硼砂緩沖液(pH7.98)，在4min內出峰，電壓以16kV為佳，測定LOD為4mg/L，加樣回收率為97.9%～102.4%，RSD小于3%。Santos等采用50.5cm熔融石英CAE，以25mmoL/L磷酸緩沖液(pH6.8)為電泳緩沖液，20min內檢測了牛奶中的14種常用CEPs，LOD在0.42～0.16μg/mL之間。姚曄等采用MEKC法分離檢測5種β-內酰胺類抗生素。緩沖液為20mmoL/L Na2HPO4-20mmoL/L NaH2PO4(pH8.5)，20mmoL/L十二烷基硫酸鈉和體積分數25%甲醇，在18kV電壓下5種抗生素在15min內達到基線分離。各組分線性關系良好，LOD為5.3～8.1mg/L，進樣精密度RSD為3.8%～5.5%。該研究表明，對分子結構特別相近的抗生素，通過表面活性劑膠束固定相與有機添加劑協同作用來改善分離效果是可行的。Bailon-Perez等采用毛細管電泳-串聯質譜(CE-MS/MS)法檢測了雞肉中9種PENs(蔡夫西林、雙氯西林、氯唑西林、苯唑西林、氨芐西林、青霉素G、阿莫西林、青霉素V和哌拉西林)殘留。雞肉樣品經乙腈提取后，采用OasisHLB柱和氨基柱分別進行凈化，CE分離柱為填充硅膠柱(96cm×360μm，50um)，緩沖液為60mmoL/L醋酸銨緩沖液(pH6.0)，離子阱質譜儀(MSn)，ESI電離源，多反應監測(MRM)模式檢測。該方法測得雞肉樣品的LOD為8～12μg/kg。

(4)氣相色譜法(gaschromatography，GC)

β-內酰胺類藥物為強極性、熱不穩定性和難揮發性化合物，采用GC測定時，需要進行甲酯化衍生反應來提高其揮發性和降低極性。常用的檢測器主要有氮磷檢測器(nitrogen-phosphorus detector，NPD)和質譜檢測器(mass spectrometry detector，MSD)等。由于GC方法前處理步驟繁鎖，目前已很少用于β-內酰胺類藥物殘留的實際檢測。Preu等建立了牛肉中青霉素的GC同位素稀釋檢測方法。樣品經乙腈和磷酸鹽緩沖液(pH2.2)提取，NaCl、二氯甲烷和Na2SO4除去水，旋轉蒸干后，分別采用石油醚/磷酸鹽緩沖液(pH7)、磷酸鹽緩沖液(pH7)億醚、磷酸鹽緩沖液(pH7)/二氯甲烷、磷酸/二氯甲烷進行LLP，然后采用陰離子交換柱進行凈化，再用磷酸鹽緩沖液(pH2.2)/二氯甲烷進行LLP凈化，氮吹蒸干后，用重氮甲烷進行衍生化，使用GC-NPD或GC-MS進行檢測。采用熔融石英的交聯甲基聚硅氧烷膠毛細管柱(30m×0.25mm，0.25um)進行分析，程序性升溫模式分離，電子電離(EI)，選擇離子(SIM)模式監測。該方法測得青霉素的LOD為3ug/kg。該試驗比較了使用不同內標和不使用內標檢測青霉素G的區別，發現使用13C同位素內標回收率較好。Meetsehen等用GC測定牛奶和動物組織中7種PENs。用重氮甲烷衍生化，形成易揮發的青霉素甲基酯類化合物，有效提高了檢測靈敏度和再現性。采用毛細管柱(30m×0.26mm，0.1um)進行分析，程序升溫模式分離，進樣體積3μL。方法回收率在46%～73%之間，牛奶和組織中PENs的LOD小于3μg/kg。

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