糖皮質激素類藥殘留分析技術測定方法——免疫分析法

時間：2023-03-25 02:57:52來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

糖皮質激素類藥殘留分析技術測定方法——免疫分析法

[db:作者] / 2022-12-19 00:00

(5)免疫分析法(immunoassay，IA)

1)放射免疫分析法(radioimmunoassay，RIA)

RIA將放射性的靈敏度與免疫的特異度融合于一體，既簡便準確，又靈敏可靠。Blahova等報道了采用RIA測定血清、血漿和尿液中的氫化可的松的方法。采用RIA試劑盒直接檢測樣品中氫化可的松的含量，無需提取，而尿液樣品既可以直接檢測也可以提取后檢測。樣品與包被有氫化可的松示蹤劑(125I標記)的單克隆抗體孵育1h，水平400r/min振蕩1h，多通道γ計數器檢測，標準曲線計算氫化可的松的濃度。該RIA方法的線性范圍為3.64～725ng/mL，LOQ為3.64ng/mL，CV為0.27%～13.%。采用HPLC和該RIA方法對66份鯉魚樣品進行分析，相關性為HPLC=0.9454RIA+0.40676，相關系數為0.815。

2)酶聯免疫分析法(enzyme linked immunosorbent assays，ELISA)

ELISA是采用抗原與抗體的特異反應將待測物與酶連接，并將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使抗原抗體反應在固相載體表面進行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除，然后通過酶與底物產生顏色反應，用于定量測定，靈敏度高，操作安全，不需要昂貴的儀器，可以滿足大批量快速篩選的需求。

Roberts等報道了采用ELISA方法檢測馬尿中的地塞米松。藥物-蛋白結合物被固定在微孔板上，抗體與樣品或標準品和藥物-蛋白結合物競爭。抗體與固定在微孔板上的藥物-蛋白結合物結合的比例可以被原位測定，而達到定量目的。該方法在0.75ng/mL、1.5ng/mL、5.0ng/mL三個添加濃度回收率為102.0%～141.7%。與RIA法比較，并經GC-MS驗證，該ELISA方法不僅快捷、方便，而且準確率高。胡擁明等分別以地塞米松、倍他米松、雙氟米松為半抗原制備抗體，結果發現地塞米松抗體的群選性最強，對雙氟米松、倍他米松、曲安西龍和潑尼松龍的交叉反應率分別為120%、73%、37%和21%，對其他3種內源性類GCs交叉反應率均小于0.1%。由此建立了間接競爭ELISA方法檢測雞肌肉組織中的GCs。1g組織樣本，加入3mL的蒸餾水，渦旋混合1min，加入4mL的乙酸乙酯，搖動樣本30min，4℃下2000r/min離心10min，吸取1mL的上清液于玻璃試管中，50℃時在適當的氮氣流下進行揮發T燥，將殘渣溶解于0.5mL 10%甲醇的PBS溶液，ELISA檢測。該方法的回收率為61.3%～80.3%，CV小于15%，地塞米松、倍他米松、雙氟米松的LOD分別為0.14ng/mL、0.56ng/mL和0.21ng/mL。同時，將ELISA方法與LC-MS法對比，相關系數為0.9981，表明兩者具有很高的相關性。Kolanovic等建立了可以在歐盟MRL或要求檢出水平(RPL)下快速、靈敏地定性篩查測定牛奶與尿液中地塞米松、倍他米松、氟米松和潑尼松龍，以及肝臟樣品中地塞米松、氟米松和潑尼松龍的ELISA方法。依據歐盟2002/657/EC標準，通過測定CCβ、特異性、LOD、LOQ、回收率、實驗室內重現性、線性和耐用性等對建立的定性篩查方法進行確認。牛奶、尿及肝臟樣本的LOD分別為0.2μg/kg、1.2μg/kg和0.6μg/kg，LOQ分別為0.3μg/kg、1.2μg/kg和1.4μg/kg。地塞米松、氟米松、β-米松和潑尼松龍的添加回收率分別為68%～131%、57%～120%、60%～155%、23%～32%，CV在1.6%～21.2%之間。所有被測基質中CCβ低于MRL/RPL。通過適度改變肝臟和牛奶樣品前處理中一些關鍵因素對可靠性進行評價，結果發現未對GCs檢測造成任何不良影響。

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